Obsah
Lise je grécke slovo a jednoducho znamená „rozdeliť“ alebo „rozložiť“. Je to dobrý opis reakcie, ktorá sa vyskytuje s bunkami v lyzačnom pufri, čo je roztok, ktorý ich rozloží a extrahuje ich obsah. Vedci používajú tieto roztoky na extrakciu DNA alebo proteínov pri bunkovej analýze, najmä v prípade baktérií. Typ tlmivého roztoku na lýzu buniek sa líši v závislosti od typu experimentu, spomenieme však niektoré bežné možnosti.
Pufr a soľ
Pufrové roztoky stabilizujú pH, zatiaľ čo bunky prechádzajú procesom lýzy. Roztok tris-HCL je najbežnejším tlmivým roztokom na tlmenie pri pH 8, ak je požadované pH. HEPES je ďalším bežným tlmivým roztokom v týchto experimentoch. Môže sa tiež pridať chlorid sodný na zvýšenie iónovej sily, celkovej koncentrácie rozpustených látok mimo buniek. Toto je dôležité, pretože voda sa môže šíriť do všetkých bunkových membrán, od oblastí s nízkou koncentráciou rozpustených látok do oblastí s vysokou koncentráciou.
Čistiaci prostriedok
Detergent je hlavná zložka, ktorá rozpúšťa bunkovú membránu, takže jej obsah môže unikať. Detergenty sú amfipatické molekuly, to znamená, že jeden koniec ľahko interaguje s molekulami vody, zatiaľ čo druhý hydrofóbny koniec, čiže „ktorý sa bojí vody“, túto interakciu nerobí. Môžu rozpúšťať tuky tvorením micel, malých skupín, v ktorých hydrofóbne konce molekuly detergentu smerujú dovnútra k molekulám tuku. Bežné detergenty sú dodecylsulfát sodný alebo SDS, NP-40 a tritonX.
Chelatačné činidlá a inhibítory
Lyzačné pufre zvyčajne obsahujú aj chelatačné činidlá, ako je kyselina etyléndiamíntetraoctová (EDTA) alebo kyselina retylénglykoltetraoctová (EGTA). Tieto chemikálie sa viažu na ióny kovov s nábojom +2 (napríklad horčík a vápnik), a preto sú pre ďalšie reakcie nedostupné. Mnoho DNAz (proteíny, ktoré žujú DNA) a proteáz (proteínov, ktoré štiepia iné proteíny) potrebujú na prácu ióny horčíka, takže zbavením tejto hlavnej zložky, EDTA a EGTA, pomáhajú znižovať hladinu proteázy alebo aktivity DNAázy. Nevylučujú ich však úplne a niektoré proteázy nezávisia od kofaktorov horčíka, takže lyzačné pufre niekedy obsahujú aj látky nazývané inhibítory proteázy, ktoré sa na ňu viažu a bránia jej správnemu fungovaniu.
Alkalická lýza
Alkalická lýza je veľmi častou technikou na čistenie plazmidov od baktérií. Táto metóda predpokladá použitie troch riešení. Prvý obsahuje glukózu, pufr tris-HCL, EDTA a RNAsy. Glukóza vytvára vysokú koncentráciu rozpustenej látky mimo baktérií, takže sú mierne ochabnuté, čo uľahčuje proces lýzy. EDTA a tris-HCL fungujú tak, ako už bolo opísané, zatiaľ čo RNAáza bude žuvať akúkoľvek RNA vo vnútri bunky, aby ju dostala z cesty. Druhé riešenie účinne robí lýzu buniek. Obsahuje detergent SDS a NaOH, ktoré zvyšujú pH na 12 alebo vyššie, denaturujú proteíny vo vnútri bunky a spôsobujú, že sa DNA rozdeľuje na jednoduché vlákna. Tretí roztok obsahuje octan draselný na obnovenie neutrálnej hodnoty pH, aby sa mohli reťazce plazmidovej DNA spojiť. Medzitým sa denaturované proteíny spoja a vyzrážajú, zatiaľ čo dodecylsulfátové ióny sa spájajú s draselnými iónmi za vzniku nerozpustnej zlúčeniny, ktorá sa tiež môže vyzrážať z roztoku.